【正文】摘   要：我国每年都有因食带有TTX的海洋生物而导致中毒的事件发生。鉴于河豚毒素的严重危害，有必要建立一种简便、快速有效检测河豚毒素的方法。
　　关键词：海洋生物 河豚毒素 测定研究
　　1 引言。河豚毒素（Tetrodotoxin，TTX）是一种天然海洋生物神经毒素，分布广泛，主要存在于河豚鱼中，圆尾鲎、蓝环章鱼、螺类等其它海洋生物中也有存在。河豚毒素毒性极强，食用0.5mg就可致人死亡，其带正电荷的胍基能伸入钠通道的离子选择过滤器，和通道内壁上的游离羧基结合，阻碍Na+进入，从而抑制神经冲动的传导，使人感觉神经麻痹，四肢瘫痪，呼吸困难，最后因呼吸抑制而死亡。我国每年都有因食带有TTX的海洋生物而导致中毒的事件发生。鉴于河豚毒素的严重危害，有必要建立一种简便、快速有效检测河豚毒素的方法。
　　目前，河豚毒素的检测方法有生物测定法、高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱串联质谱法（LC-MS）及酶联免疫法（ELISA）等。其中，生物测定法一般需要专门动物，适用性差，且操作繁琐，费时费力重复性差；酶联免疫法虽特异性强，但酶联免疫反应耗时长，操作难度较大；液相色谱串联质谱法灵敏度高，但现有的文献方法检出限偏高，前处理复杂，且采用的固相萃取技术净化样品不理想、易受基质干扰，回收率低。免疫亲和柱（IAC）是一种基于抗原抗体反应的新型层析柱，利用生物大分子具有对类生物大分子特异识别和可逆结合的特性制作而成，具有独特的选择专一性和良好的吸附净化性能。目前，尚未见以免疫亲和柱作为前处理净化手段检测河豚毒素的相关报道，本实验基于液相色谱串联质谱的高灵敏性和精确性，利用免疫亲和柱的独特选择识别性，建立一种快速、简便、高效测定海洋生物中河豚毒素的分析方法。
　　2 实验部分
　　2.1 仪器与试剂
　　ACQUITY超高效液相色谱-质谱仪Quattro Premier XE（美国Waters公司）；MS2漩涡混合器（德国IKA公司）；N-EVAP-112氮吹仪（美国Organomation公司）；Centrifuge5810高速离心机（德国Eppendorf公司）；12通道固相萃取装置（美国Supelco公司）。  TTX标准品（纯度≥98.0%，德国Dr.Ehrenstorfer公司）；TTX免疫亲和柱（柱容量3 mL，北京华安麦科生物技术有限公司）；乙腈、甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；乙酸铵、甲酸（美国Sigma公司）；乙酸、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、NaCl、NaOH（上海国药集团）；实验用水均为超纯水。
　　2.2 溶液的配制
　　TTX标准溶液：准确称取5.00 mg TTX标准品，用0.1%甲酸-乙腈（1∶1， V/V）溶液溶解并定容至50 mL，4℃避光保存，保存期限为6个月；使用时逐级用0.1%甲酸-乙腈溶液（1∶1， V/V）稀释至100μg/L。磷酸盐缓冲液（PBS）：分别称取Na2HPO4·12H2O 6.45 g，NaH2PO2·2H2O 1.09 g， NaCl 4.25g，用水溶解并定容至500 mL。
　　2.3质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描（ESI+）；检测方式：多反应监测（MRM）；毛细管电压： 3.0 kV；离子源温度：110℃；脱溶剂气温度：350 ℃；锥孔气流量：50 L/h；脱溶剂气流量：600L/h；锥孔电压、碰撞能量、分析物母离子及子离子等质谱多反应监测实验条件如表1所示。
　　2.4 样品处理
　　2.4.1 样品提取 称取已充分均质样品2.00 g于50 mL具塞离心管中，加入10 mL含有1%乙酸的甲醇溶液，涡旋振荡2 min，60℃水浴超声提取15 min，冷却至室温后，6000 r/min离心5 min。移取5 mL上清液至另一个50 mL离心管中，加入20 mL PBS溶液稀释，用1 mol/L NaOH调至pH 7～8，待净化。
　　2.4.2 免疫亲和柱净化 取出免疫亲和柱，待回至室温，去掉亲和柱堵头，放出柱内保存液后，上样品液。上样结束后，用8mL水淋洗亲和柱，挤干柱内残留液，并弃去以上全部流出液，最后用4 mL含有1%乙酸的甲醇溶液洗脱，收集的洗脱液于60℃氮气吹干，用1mL流动相溶解并定容，经0.22 μm滤膜后供液相色谱-质谱分析。
　　3 结果与讨论
　　3.1 色谱与质谱条件选择
　　TTX由于亲水性和极性较强，在一般的反向色谱柱上不易保留，而ACQUITY UPLC BEH  Amide色谱柱作为专用于强极性化合物分析的亲水色谱柱，对TTX保留性强，且具有较好的色谱峰形，满足TTX液相色谱分析的需要。乙酸铵溶液能促进TTX胍电离，并为阳离子的形成提供了质子来源，提高TTX离子化效率；甲酸能通过调节流动相pH达到合适的分离效果，改善色谱峰形。本实验研究比较了多组不同体积分数甲酸及不同浓度乙酸铵溶液对色谱分析的影响。结果表明，以0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸铵溶液与乙腈为流动相具有良好的色谱分离效果，且峰形尖锐对称。
　　3.2 提取试剂的选择
　　TTX是一种氨基全氢喹唑啉型化合物，只溶于酸性水或有机溶液。本实验比较了乙腈和甲醇对TTX的提取效率。乙腈作为常用的提取试剂，提取效率较好，但毒性较大；考虑到甲醇能迅速穿透组织，沉淀蛋白质，并具有脱水性，是提取TTX的良好试剂。
　　3.3 免疫亲和柱条件优化
　　免疫亲和柱的亲和结合作用与样品液的pH值直接相关，不适宜的pH值会使亲和作用减弱或破坏。本实验采用HCl和NaOH调节样品液pH值，通过比较不同pH值下TTX的回收率，考察不同pH值下免疫亲和柱的亲和作用能力，当pH=7～8时，亲和作用能力最佳，TTX回收率最高；当pH<6.5或pH>9时，亲和能力明显减弱，由此确定pH=7～8时为TTX免疫亲和柱的最适宜pH值。当使用8 mL水淋洗亲和柱时，杂质可基本除去，而TTX未被洗脱下来；TTX几乎已完全洗脱，回收率也趋于稳定。因此本实验采用8 mL水作为淋洗液，4 mL含有1%乙酸甲醇作为洗脱液。
　　3.4 实际样品分析
　　采用本方法对鹰爪虾、对虾、海鳗、荔枝螺、单齿螺、织纹螺、枪乌贼、曼氏无针乌贼、贻贝、花蛤、三疣梭子蟹、细点圆趾蟹、圆尾鲎等共计13种样品进行检测，其中织纹螺、花蛤、圆尾鲎样品中检出TTX，浓度依次为56.4， 2.43和174  μg/kg。分析结果表明，本方法采用免疫亲和柱净化、液相色谱-串联质谱法检测海洋生物中河豚毒素，灵敏度高，精密度和回收率均能满足检测分析的要求。